Obraz powstał w trzechsetną rocznicę podpisania unii między Polską i Litwą, co miało miejsce w 1569 roku na Zamku w Lublinie. W jej wyniku powstała Rzeczpospolita Obojga Narodów, która przetrwała aż do rozbiorów. Dzieło Matejki przedstawia moment uroczystego odczytania i zaprzysiężenia dokumentu potwierdzającego powstanie unii. Malując to jedno z najważniejszych wydarzeń w historii Polski, Matejko chciał pokrzepić serca swoich rodaków po upadku kolejnego powstania oraz zachęcić ich do dalszej walki o niepodległość ojczyzny.
„Unia Lubelska” początkowo była prezentowana była w Krakowie do 15 września 1869 r., co było jedyną formą uczczenia rocznicy unii, a następnie pokazywano ją w Wiedniu, Pradze, Paryżu i Londynie. We Lwowie była wystawiona aż do 1944 roku, kiedy to Niemcy wywieźli obraz na Dolny Śląsk – wówczas niemiecki – do miejscowości Hain (dziś Przesieka) niedaleko Jeleniej Góry. Po wojnie obraz stał się własnością Muzeum Narodowego w Warszawie. W 1957 roku został przekazany w depozyt Muzeum Lubelskiemu jako podziękowanie miastu za ukrycie przed Niemcami w czasie II wojny światowej innych dzieł Matejki: „Bitwy pod Grunwaldem” i „Kazania Skargi”. Od tamtej pory obraz prezentowany jest w Galerii Malarstwa Polskiego XVII-XIX wieku w reprezentatywnym miejscu, pośrodku sali.